“植物全基因组表面”觉得，每一植物个体齐是植物与微生物构成的生命共同体，植物与微生物相互作用，运转植物进化与演变[1-2]。内生真菌定殖于植物里面亚洲色图 自拍偷拍，是植物-微生物系统的垂危构成部分[3]。它们参与宿主植物代谢，共同塑造了复杂的植物代谢谱。内生真菌不仅能代谢生成与宿主植物谈判或不异的活性产物，也能通过影响和调整药用植物次生代谢产物的合成、含量及蕴蓄，径直能够障碍地影响药用植物活性物资的踱步和含量[4]。内生真菌的次生代谢物复杂各样、骨架结构新颖，是自然药物筹办潜在的资源宝库[5]。

灯盏花[Erigeron breviscapus (Vant.) Hand.-Mazz.]以全草入药，临床上主要用于心脑血管疾病的调治，每年商场销售额高达5亿元傍边，具有较高的药用和经济价值[6]。联系灯盏花的筹办主要集结于化学物资基础揭示、药理学筹办及基因组援救分子育种等方面，对于其内生真菌方面的筹办当今仅限于可培养的种类[7-9]。由于当然界绝大多数微生物(99%)尚不行培养，导致其中蕴含的微生物暗物资(microbial dark matter)和难以培养微生物信息的缺失，严重影响对灯盏花内生真菌群落结构各样性的评估[10]。使用宏基因组高通量测序技能设施分析微生物群落结构是当今最垂危、最飞快的菌群结构与功能意识的设施之一[11]。时常使用真菌特异性引物进行系统发育象征分子(internal transcribed spacer， ITS)的扩增，并通过测定其序列来识别微生物群落的物种构成，定量其品貌[12]。

本筹办接管ITS序列的高通量测序设施，以云南产多年生进修灯盏花为筹办对象，通过分析灯盏花内生真菌各样性、群落构成和功能谋略，初步发扬灯盏花内生真菌在不同植物组织中的踱步特征和生态功能，以期为后续发现关键收尾基因、挖掘自然产物合成基因簇、促进微生物资源的深度建立与哄骗奠定表面基础。

1 材料与设施 1.1 材料

1.1.1 样品收罗

灯盏花植物样品于2022年1月采自云南省红河州泸西县灯盏花栽种基地(24°40′25″N， 103°46′24″E)，采用4个灯盏花长势一致且处于初花期的采样点，每个采样点取10株发育邃密的整株植物，根部带土置于冷链箱内带回实验室，在24 h内不休样品。

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1.1.2 培养基、主要试剂和仪器

本质所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar， PDA)培养基(g/L)：马铃薯200.0，葡萄糖20.0，卵白胨5.0，琼脂20.0。

HiPure Soil DNA索求试剂盒，Magen公司；Q5® High-Fidelity PCR Kit，New England Biolabs公司；AxyPrep DNA凝胶索求试剂盒，Axygen Biosciences公司。

精密电子天平，上海菁海仪器有限公司；电热恒温水槽，上海博迅实业有限公司；袖珍台式高速冷冻离心计，Labogene公司；电泳仪和凝胶成像系统，北京市六一仪器厂；ABI Step One Plus及时PCR系统，Life Technologies公司；Illumina NovaSeq 6000，Illumina公司。

1.2 样品不休

用自来水洗净灯盏花植株后，将其分为根、茎、叶和花等4个部位，每个部位设3个重迭组，分别象征为R1−R3、S1−S3、L1−L3、F1−F3。然后置于75% (体积分数)酒精中漂洗3 min、无菌水冲洗3次后，再置于5% NaClO溶液中漂洗2 min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干水分。哄骗组织印迹法和漂洗液检会法检会组织块名义消毒是否透顶和一致。样品用铝箔纸包好后，液氮冷冻保存亚洲色图 自拍偷拍，用于后续内生真菌总DNA的索求。

1.3 ITS文库构建及高通量测序

接管HiPure Soil DNA索求试剂盒，参照讲解书索求灯盏花植物样本中总DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质地。考取真菌ITS1‒ITS2区进行扩增，所用引物为ITS1F (5′-CTTGGTCA TTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R (5′-GCTGCG TTCTTCATCGATGC-3′)[13]。使用Q5® High-Fidelity PCR Kit进行PCR反应。PCR反应体系：Q5 High-Fidelity 2×Master Mix 12.5 µL，正、反向引物(10 µmol/L) 1.25 µL，dNTPs终浓度200 µmol/L，DNA模板30 ng，ddH2O补足25 µL。PCR反应条目：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，33个轮回；72 ℃ 7 min。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测，哄骗AxyPrep DNA凝胶索求试剂盒进行纯化，并使用ABI Step One Plus及时PCR系统进行定量。纯化后的扩增子把柄次序操作在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端测序，由广州基迪奥生物科技有限公司完成。

1.4 数据不休和分析

原始数据通过FASTP v0.18.0进行过滤，去除接头序列后，采用FLASH v1.2.7软件进行拼接，参照QIIME软件分析历程过滤低质地碱基[14]，基于UCHIME算法过滤嵌合体后得到高质地的reads数，接管UPARSE (v9.2.64)按≥97%不异度聚类为OTU。使用R讲话ggplot2包(v2.2.1)绘画物种品貌堆叠图、稀释弧线和秩-品貌(rank abundance)弧线。分别通过R讲话pheatmap包(v1.0.12)、Venn Diagram包(v1.6.16)绘画物种品貌热图和韦恩图。采用QIIME v1.9.1揣度Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和ACE指数。基于OTU和物种品貌表，借助R讲话Vegan包(v2.5.3)进行基于Unweighted UniFrac距离的主坐标分析(principal coordinates analysis， PCoA)。FUNGuild v1.0用于推断内生真菌的生态养分型和功能型[15]。测序原始数据已上传至NCBI，情势编号为PRJNA901262。

2 恶果与分析 2.1 灯盏花内生真菌测序恶果分析

来自灯盏花4个不同组织共计12个样品进行ITS序列的高通量测序，共赢得raw reads 1 553 799对(表 1)。原始下机数据进行双端拼接、质地收尾和嵌合体过滤后进行高质地数据统计，共赢得1 549 371对clean reads。经过overlap拼装共赢得原始tags数量为1 370 251，质控去除嵌合体后赢得高质地tags数量为1 361 589，样本灵验数据在78.14−93.75之间，序列读长踱步在211−474 bp之间。测序数据Q20值不低于90.98%，样本的GC含量在43.90%−47.22%之间(表 1)。

样本稀释弧线障碍反应样本中物种的丰富进程，如图 1所示为灯盏花不同组织样品稀释弧线，各弧线阐述为先急剧飞腾，之后跟着测序量的增多趋于简约，标明各样品物种测序量趋于饱和，测序深度已基本遮掩样品中的系数物种。

Rank-abundance弧线可直不雅反应样本物种多度和均匀度。图 2恶果清楚，灯盏花根和茎样品弧线相较其叶和花的弧线鸿沟较宽且较简约，教导灯盏花根和茎中内生真菌品貌大于叶和花，且物种踱步比较均匀。

2.2 灯盏花内生真菌OTU分析

为探究灯盏花不同组织部位内生真菌的OTU共有和稀奇情况，通过维恩图分析发现，12个样品共得到540个OTU，其中4个组织共有OTU数量为78个，花、叶、根和茎组织中特有的OTU数量分别为75、26、148和87个(图 3)。教导灯盏花不同组织器官中内生真菌OTU构成存在一定互异。各组织特有属方面，4个组织共有属为52个，花、叶、根和茎组织中特有属分别为21、4、26和17个。已知属中，花中稀奇布勒掷孢酵母属(Bullera)、球腔菌属(Mycosphaerella)和Hormonema这3个菌属，叶中稀奇淡领瓶霉属(Cadophora)、胶被盘菌属(Crocicreas)这2个菌属，根中稀奇Dactylonectria、Thaumatomonas和圆孢霉属(Staphylotrichum)这3个菌属，茎中稀奇葡萄座腔菌属(Neofusicoccum)、斯氏格孢属(Spegazzinia)和栓菌属(Trametes)这3个菌属。这些菌属相对品貌均 < 1%。

2.3 灯盏花内生真菌群落构成

进一步将各组织部位的OTU代表序列进行群落组因素析，这些序列分属于5个门22个纲55个目114个科188个属。从物种踱步堆叠图来看，在门水平上(图 4A)，灯盏花不同组织的内生真菌占上风的均为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，但存在组织互异。子囊菌门真菌在灯盏花的根中平均相对品貌高达92.99%，而在花中平均相对品貌仅占31.62%。担子菌门真菌在灯盏花的花中平均相对品貌达68.33%，而在根中平均相对品貌仅为4.86%。除根中未分类的群落平均相对品貌达1.66%外，其余门平均相对品貌均小于1%。

在属水平上(图 4B)，灯盏花植物花中内生真菌上风属为Cystofilobasidium (32.50%)、线黑粉菌属(Filobasidium， 29.36%)。在叶中上风属为亚隔孢壳属(Didymella， 58.12%)、织球壳属(Plectosphaerella， 11.59%)。根中上风属则为未分类菌属(Unclassified， 34.87%)、织球壳属(29.19%)、亚隔孢壳属(22.83%)。茎中上风属为线黑粉菌属(50.41%)、亚隔孢壳属(17.13%)。从图 4B可直不雅地看出，亚隔孢壳属在各个组织均有踱步，但主要定殖在灯盏花叶组织中。线黑粉菌属则主要定殖于花和茎组织中，而Cystofilobasidium主要定殖于花组织中。织球壳属主要定殖于根和叶组织中，这些菌属均呈现出显着的组织偏好。

考取内生真菌相对品貌Top30的属绘画物种踱步热图并进行聚类分析(图 5)，恶果清楚在属水平上，叶与茎样品可聚为一类，阐述出不异的群落结构，而根样品则相对孤苦，群落结构与其他组织存在互异。

2.4 灯盏花内生真菌各样性分析

对灯盏花植物各组织中的内生真菌群落进行α各样性分析，Chao1指数和ACE指数主要反应物种的品貌，而Shannon指数和Simpson指数笼统体现物种的品貌和均匀度，数值越大，各样性越高。接管Tukey HSD (Tukey’s honestly significant difference)检会对各指数进行多重比较，并通过绘画盒型图分析(图 6)。恶果清楚，花、茎和叶间的ACE指数及Chao1指数无权贵互异(P > 0.05)，而根的ACE指数及Chao1指数显着高于花、茎、叶(P < 0.05)。比较4个组织的Shannon指数和Simpson指数，恶果无权贵互异(P > 0.05)。教导根部内生真菌品貌显着高于其他组织，但根、茎、叶和花各组织间的各样性互异不权贵。

为潜入意会不同组织样本群落构成的互异性，在OTU水平进行主坐标分析(PCoA)，通过降维神气寻找复杂样本中的主要样本互异距离(图 6)。本筹办基于样本间的Unweighted UniFrac数据恶果绘画了PCoA图。恶果清楚，第一主轴(PCo1)和第二主轴(PCo2)分别讲解注解了OTU水平真菌群落结构变化的25.46%和18.47%，两个主轴揣度讲解注解了43.93%的方差孝敬率(图 7)。四个组织样品踱步于第1、2、3象限中，叶与茎样品相对集中于第3象限，而根样品显着集中于第1象限，教导叶、茎两个组织中内生真菌菌群种类不异进程较高，而根样品与其他组织样品菌群种类互异较大，群落结构相对孤苦。

2.5 灯盏花内生真菌群落功能谋略

基于FUNGuild对灯盏花不同组织内生真菌群落进行功能谋略分析。如图 8所示，灯盏花不同组织中均存在一定比例的未分类菌落(unassigned)，其平均相对品貌占比由高到低分别为茎(30.05%) > 根(29.68%) > 花(26.62%) > 叶(24.58%)。其次，在各组织中平均相对品貌均逾越10%的功能群还有病理-腐生育分型(pathotroph-saprotroph)，其平均相对品貌占比由高到低分别为叶(54.84%) > 茎(23.90%) > 根(23.83%) > 花(15.54%)；而腐生育分型功能群(saprotroph)在花和茎样品中占有相对较高的比例，其平均相对品貌分别达55.97%和42.73%。此外，病理-腐生-共生育分型功能群(pathotroph-saprotroph-symbiotroph)在根和叶样品中平均相对品貌分别为42.77%和11.00%。其余养分功能类群在各组织中占比均较低，其平均相对品貌≤1%。

对各组织样品中平均相对品貌逾越1%的功能菌群进行详确的物种生态功能谋略分类。如图 9所示，与前边分析恶果一致，在灯盏花植物各组织中均存在特别比例的未分类菌落(unassigned)。灯盏花内生真菌中已果断出的主要生态功能菌是动物病原菌-植物病原菌-未界说腐生真菌(animal pathogen-plant pathogen- undefined saprotroph)，在各组织中均有踱步，且以叶组织为主，其上风类群为亚隔孢壳属。具有未界说腐生真菌(undefined saprotroph)生态功能的线黑粉菌属，主要踱步于花和茎中。具有动物病原菌-内生菌-真菌寄生虫-植物病原菌-木质腐生菌(animal pathogen-endophyte-fungal parasite- plant pathogen-wood saprotroph)生态功能的织球壳属主要踱步于叶和根中。值得瞩见地是，具有叶腐生菌(leaf saprotroph)功能的菌群为Cystofilobasidium，主要踱步于花中，虽叶中也有定殖，但平均相对品貌仅有3.74%。其余生态功能群平均相对品貌占比均未逾越10%。

3 考虑与论断

云南是我国生物各样性最丰富的地区之一，其中赋存很多寥落、特有、陈旧的爱戴菌群。本筹办所用灯盏花采自云南省灯盏花主产地红河州。该地区处于北追念线上，稀奇的泥土环境和风光条目较适合栽种出高质地的灯盏花药材。“红河灯盏花”已被列为中国国度地舆标识家具。该药用植物中蕴含的内生真菌生物各样性、群落结构及生态功能具有垂危的筹办价值。

灯盏花各样性方面，从Rank-abundance弧线来看，灯盏花中内生真菌群落在根和茎中相对丰富且踱步均匀。从OTU凝视的物种共有和稀奇情况来看，4个不同药用部位共有的OTU数量仅占14.45%，而根部位的稀奇OTU数量最多。与该恶果一致，PCoA分析恶果标明，根部位的内生真菌群落结构与其他组织比拟具有显着互异。叶与茎组织的内生真菌群落构成则存在一定进程的不异性。这可能是由于地上部分与地下部分定殖环境不同，变成根部内生真菌群落结构相对孤苦[16]。另一方面，从植物剖解学来看，叶与茎密切承接，形成了不异的定殖环境，而叶与茎进化关系密切可能是内生真菌群落起首邻近的原因之一。各样性方面，α各样性分析标明，根的ACE指数及Chao1指数显着高于花、茎、叶，教导根部内生真菌品貌高于其他地上部分。与本筹办恶果近似，前期基于传统分离培养法发现从灯盏花根部位等分离赢得的内生真菌种群和数量均最多[7， 9]。这可能与根部周围环境联系，在根和泥土之间的接壤处存在很多凋落物(腐叶、枯枝)以及根际分泌物(rhizosphere exudates)，它们为根际周围的真菌提供富足的碳、氮和微量元素，故意于内生真菌的定殖与养殖[17]。

植物内生真菌群落结构受宿主种属、植物组织器官及泥土类别、风光海拔等环境因素影响而呈现各样性[18]。在诸多因素中，植物组织器官在决定群落结构构成上具有垂危意念念[19]。本筹办中，灯盏花内生真菌群落组因素析标明，不同灯盏花组织样品中，内生真菌上风门、属和特有属不同，具有一定的组织特异性(图 4)。与此恶果一致，可培养法分离到的灯盏花内生真菌种群数量踱步也呈现组织专一性[7， 9]。所不同的是，可培养的灯盏花内生真菌群落等分离到5个目7个科22个属的内生菌，其中交链孢属(Alternaria)、镰孢霉属(Fusarium)为灯盏花内生真菌上风菌属[7， 9]。本筹办共凝视到55个目114个科188个属的内生菌，凝视到的内生菌种群数量广宽于可培养的灯盏花内生真菌群落。其中上风属则为亚隔孢壳属、线黑粉菌属和织球壳属。尽管咱们在灯盏花各组织样本中均凝视到Alternaria和Fusarium，但其平均相对品貌均小于10%。这可能是由于高通量测序能探伤到的生境物种丰富，两种菌属在物种构成中的占比受到稀释所致。

FUNGuild矜恤真菌的养分战术，不错从复杂群落分类中索求出更易不休和意会的生态单元。该生态单元把柄养分类型别离，将接管谈判养分神气的干系或不干系物种归为一类。本筹办中，FUNGuild功能谋略恶果清楚，灯盏花不同组织样品以各式类型的腐生真菌为主要养分功能类群。与该筹办恶果一致，Wang等[20]评价了中国西北药用植物苦豆子(Sophora alopecuroides)的内生真菌各样性，发现这些内生菌可分为15个生态功能群，其中腐生真菌占十足上风。为顺应复杂多变的生涯环境，真菌在植物的不同期期可接管多种生活神气，包括腐生、内生和病原等[20-21]。它们之间的变装鬈曲关系有待潜入筹办。高通量测序还发现灯盏花各组织中存在多数的未知功能群，其相对品貌均 > 10%，以茎和根中最多。其中可能蕴含新的物种和爱戴的菌种资源，有待进一步挖掘。

此外，咱们还在灯盏花植物中，发现了一些其他内生菌属。如在各组织中均有踱步且主要踱步在叶组织中的上风类群亚隔孢壳属。进一步分析发现，该物种凝视到种水平为Didymella bellidis。亚隔孢壳属大多数真菌是关键的植物病原菌，在植物病理学筹办方面具有垂危的筹办价值。频年来筹办标明，D. bellidis可致雏菊(Bellis perennis)、茶树(Camellia sinensis)、当归(Angelica gigas)等多栽种物发生叶斑病[22-24]。对于灯盏花叶斑病病原菌，当今盛大觉得是由链格孢属的细交链孢(Alternaria alternata)侵染所致[25]。本筹办在灯盏花各组织中发现了亚隔孢壳属，其是否是灯盏花叶斑病的潜在病原菌有待潜入筹办。

灯盏花植物主要灵验因素以黄酮类化合物为主，以灯盏花乙素笔名野黄芩苷(scutellarin)为代表。本筹办中亚洲色图 自拍偷拍，线黑粉菌属为灯盏花植物花和茎样品的上风属。Su等[26]从陈皮等分离出一株担子菌酵母菌Filobasidium magnum，其发酵液能将川陈皮素(nobiletin)代谢生成黄酮类物资。线黑粉菌属在灯盏花乙素(scutellarin)代谢网中的作用值得链接探究。以上筹办为灯盏花病虫害防治、植物资源保护提供了新的筹办视角，同期为筛选赢得高效的产黄酮内生真菌爱戴菌株提供了陈迹。